零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過(guò) 90%的陽(yáng)性重組克隆。零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
Zero-Blunt Simple Quick Ligation Kit
pZERO-Blunt Simple零背景平末端快速連接試劑盒
(不含MCS)
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
目錄號(hào)：42113
試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 20次(42113-20) | 40次(42113-40) |
pZERO-Blunt Simple Vector(40ng/ml) | 20 ml | 40 ml |
1K bp Control（40ng/ml） | 5 ml | 5 ml |
2 ′ Quick Ligation Buffer | 100 ml | 200 ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20 ml | 40 ml |
pZERO-Blunt Simple Forward Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
pZERO/Blunt Simple Reverse Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
－20℃儲(chǔ)存，6個(gè)月內(nèi)不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過(guò) 90%的陽(yáng)性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。
試劑盒提供一個(gè)新穎的zi殺基因陽(yáng)性選擇克隆載體pZERO-Blunt Simple。該載體含有致死的zi殺基因，當(dāng)載體與片段連接成功，zi殺基因無(wú)法正確表達(dá)，包含重組子的細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)；當(dāng)載體與片段連接不成功，載體自連后zi殺基因正確表達(dá)，包含自連空載體的細(xì)胞無(wú)法存活，即“零ZERO"背景。這種陽(yáng)性篩選策略無(wú)需藍(lán)白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進(jìn)程。
pZERO-Blunt Simple消除了插入位點(diǎn)附近的多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。
操作步驟：
1. 連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：
平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長(zhǎng)波紫外光下切膠或者可見(jiàn)光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗）。與載體的摩爾比是 3:1。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對(duì)70bp以上的DNA片段能很好地進(jìn)行回收。
2. 快速連接反應(yīng)：
1) 在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10 ml連接反應(yīng)體系中，加入1 ml 40ng pZERO-Blunt Simple載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒(méi)有必要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1，見(jiàn)附錄)、5ml 2 ′ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補(bǔ)足。
反應(yīng)按以下體系進(jìn)行：
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer |
1ml | pZERO-Blunt Simple載體 |
Xml | 純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 滅菌水 |
0.9ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦22℃連接5-10分鐘 ，>3kb長(zhǎng)片段連接可以延長(zhǎng)至30分鐘。不推薦超過(guò)30分鐘，超過(guò)可能降低轉(zhuǎn)化子數(shù)量。
3) 冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。
3. 轉(zhuǎn)化：
1) 100ml感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，wan全解凍后輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。
2) 加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要連接液體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
3) 42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。
4) 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。
5) 將200ml細(xì)菌涂布在氨芐青霉su(100mg/ml)平板上。
涂布細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果 預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個(gè)平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂一個(gè)新培養(yǎng)板)。
6) 平板在37℃下正向放置1小時(shí)以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
4. 篩選：
5. 常規(guī)檢測(cè)：將得到的菌落接種 1-5 ml LB（含有終濃度為 100mg /ml 的氨芐青霉su）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
6. 快速檢測(cè)：挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)（可參見(jiàn)分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)）。
7. 測(cè)序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動(dòng)子引物測(cè)序確定是否含有目的克隆。
本試劑盒自帶測(cè)序引物（也用于菌落PCR鑒定引物）：
Forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC- 3’ |
Reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG- 3’ |
附錄：
e 如何計(jì)算連接反應(yīng)中需要的PCR產(chǎn)物的量?
一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng，插入片段大小為500bp，這時(shí)應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
