酵母高純度質粒大提試劑盒 核酸提取
本試劑盒用于高純度酵母質粒 DNA 的小量制備。菌體經堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質?？蓮木w中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除雜質，在低鹽、高 pH 條件下洗脫，最后得到純度較高的質粒 DNA。所得質?？芍苯佑糜诿盖?、轉化、PCR、RT-qPCR、測序及轉染等分子生物學實驗。酵母高純度質粒大提試劑盒 核酸提取
HiPure Yeast Plasmid Mini Kit
酵母高純度質粒大量快速提試劑盒
酵母高純度質粒大提試劑盒 核酸提取
目錄號：31119-10
產品內容：
產品組成 | 保存 | 10 次 |
溶液YP1 | 室溫 | 75 ml |
溶液YP2 | 室溫 | 75 ml |
溶液YP3 | 室溫 | 100 ml |
去蛋白液 PD | 室溫 | 63 ml |
漂洗液 WB | 室溫 | 50 ml |
洗脫緩沖液 EB | 室溫 | 20 ml |
RNase A (10 mg/ml) | -20℃ | 750 ul |
Lyticase | -20℃ | 1 g |
50ml 吸附柱和收集管 | 室溫 | 10 套 |
保存條件：
在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個月。加入 RNase A 后的溶液 P1 應置于 2 ~ 8℃
保存，可穩(wěn)定保存 6 個月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新補加即可。
產品簡介：
本試劑盒用于高純度酵母質粒 DNA 的小量制備。菌體經堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質粒可從菌體中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除雜質，在低鹽、高 pH 條件下洗脫，最后得到純度較高的質粒 DNA。所得質?？芍苯佑糜诿?/span>切、轉化、PCR、RT-qPCR、測序及轉染等分子生物學實驗。
注意事項：
1. 通常酵母的拷貝數都很低，高拷貝最大得率一般為每 5 ml 培養(yǎng)物提取 1 μg 左右的質粒。用于下游試驗時通常建議使用量為：1-5 μl 用做 PCR 模板;5-10 μl 用于轉化大腸桿菌,選擇高效率的感受態(tài)細胞。
2. 用戶需要自備 Sorbitol buffer( 1M 山梨chun， 0.1M Na2EDTA，14 mM β-巰基乙醇)。 配制方法：在 600 ml 去離子水里面溶解 182.2 克山梨chun，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調節(jié) PH 值，定容到 1L，4℃保存。臨用前加 0.1%β-巰基乙醇(商品化的 β-巰基乙醇摩爾濃度一般為 14M)。
3. 使用前請先檢查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現渾濁，如有混濁現象，可在 37℃
水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。
4. 溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若細菌量增大，需按比例放大這些溶液的使用量；
重要提示：
一、第一次使用前請先在去蛋白液 PD、漂洗液 WB 中加入指ding量無水乙醇（見瓶身標簽），充分混勻，并做好標記，以免多次加入。
二、shou次使用時請先將 RNase A 全部加到溶液YP1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。
操作步驟：
1. 取 100 - 180 ml 酵母培養(yǎng)物，12,000 x g 離心 1 min，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體，可以離心棄上清后，在同一管內加入更多的菌液，重復步驟
1，直到收集到足夠多的菌體）
2. 加入 10 ml Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；加入 0.1 g Lyticase (Lyticase 臨用前用 2ml Sorbitol buffer 溶解)，充分顛倒混勻，37℃溫育 1 – 2 小時消化細胞壁，中間可顛倒數次幫助消化。
（注意：如果破壁效果不好導致質粒產量低，可以加大 lyicase 用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間來提高效果，不適合 Lyticase 消化的酵母可選用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠渦旋，反復凍融等。）
3. 12,000 x g 離心 2 min，盡可能吸棄上清，加入 7 ml 溶液YP1，重懸菌體沉淀，渦旋震
蕩至che底懸浮。
（注意：如有未che底懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質粒濃度及純度降低）
4. 加入 7 ml 溶液YP2，溫和地上下翻轉 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。
（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 YP3 的用量也要相應增加）
5. 加入 10 ml 溶液YP3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀，
然后室溫 12,000 x g 離心 10 -15 min, 小心取上清，避免吸到白色漂浮物。
（注意：加入溶液 YP3 后應立即混合，避免產生 SDS 的局部沉淀,如果上清中還有白色漂浮物，可再次離心取上清）
6. 將上清液加入吸附柱中（吸附柱最大容量 10ml），室溫 12,000 rpm 離心 1 min，質粒被
吸附在膜上，棄濾液。重復步驟直到上清全部被加入吸附柱。
7. 可選步驟：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PD，室溫 12,000 x g 離心 1 min，棄濾液。
8. 加入 10 ml 漂洗液 WB，室溫 12,000 x g 離心 1 min，棄濾液。
（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）
9. 重復步驟 8 一次。
10. 室溫 12,000 x g 離心 2 min，甩干膜上殘留乙醇。打開蓋子室溫晾干 2 – 3 min。
（注意：此步不能省略，否則殘留乙醇會影響質粒的后續(xù)使用）
11. 將吸附柱置于一個新的 50 ml 離心管（自備）中，加入 0.6 - 1ml 的洗脫緩沖液EB，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 2 min，離心管底溶液即質粒 DNA。
（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調整其 pH值在 7.0 - 8.5 之間。）
酵母高純度質粒大提試劑盒 核酸提取
