凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒 核酸提取
細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)DNA在核小體之間發(fā)生斷裂，最終形成200bp整數(shù)倍的DNA片段，這些DNA片段被提取后，經(jīng)電泳及溴化乙錠染色后形成梯子狀外觀，謂之DNA Ladder。凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒 核酸提取
凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒
凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒 核酸提取
目錄號：40116
目錄編號 | 包裝單位 |
40116-20 | 20次 |
40116-50 | 50次 |
適用范圍：
試劑盒組成 | 保存 | 20次 | 50次 |
裂解/結(jié)合液CB | 室溫 | 6ml | 15ml |
漂洗液WB | 室溫 | 6ml | 15ml |
第一次使用前按說明加指ding量乙醇 | |||
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 15ml | 15ml |
吸附柱AC | 室溫 | 20個 | 50個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 20個 | 50個 |
適用于快速提取凋亡DNA Ladder
試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項:
1. 裂解/結(jié)合液CB低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。
產(chǎn)品介紹：
細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)DNA在核小體之間發(fā)生斷裂，最終形成200bp整數(shù)倍的DNA片段，這些DNA片段被提取后，經(jīng)電泳及溴化乙錠染色后形成梯子狀外觀，謂之DNA Ladder。血液和組織培養(yǎng)細(xì)胞在裂解/結(jié)合液中裂解后，釋放出來的DNA片段在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將DNA Ladder片段從硅基質(zhì)膜上洗脫。
產(chǎn)品特點：
1. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2. 本公司du有的裂解/結(jié)合液配方有效裂解細(xì)胞，使用本試劑盒不需要加入昂貴的蛋白酶K處理，大大降低了使用成本和加快了處理速度。
3. 節(jié)省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在10分鐘內(nèi)完成。
注意事項
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?/span>
3. 裂解/結(jié)合液CB含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 一般2×106培養(yǎng)細(xì)胞DNA產(chǎn)量為10-20μg， 200μl人全血典型產(chǎn)量為3-6μg。
5. 一般電泳檢測時典型上樣量為2-3μg純化的DNA，如果凋亡率低，有可能只見到基因組DNA，而見不到DNA ladder，可以試試加大上樣量。
操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 取2×106個細(xì)胞（懸浮細(xì)胞或者組織培養(yǎng)細(xì)胞重懸在200μl PBS中）或者200μl全血（大約含有2×106個細(xì)胞）加入200μl 裂解/結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，影響凋亡DNA ladder的觀察，可以在加入200μl裂解/結(jié)合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
細(xì)胞或者全血處理起始量最大可達(dá)300μl，如果起始量介于200μl-300μl之間，則需要按比例相應(yīng)提高后面使用試劑量。
2. 室溫（15℃-20℃）放置10分鐘。
3. 加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量。如果樣品粘稠不易混勻，則可以渦旋振蕩15秒。
4. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
5. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
6. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
7. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇影響洗脫效率和下游反應(yīng)。
8. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
9. DNA可以直接使用或者存放在－20℃，但是不要超過14天。
10. 取大約2-3μg純化的DNA電泳檢測（注意200μl人全血典型產(chǎn)量只有3-6μg）。
問題與解決方法:
問題 | 評論與建議 |
沒有DNALadder | *細(xì)胞未凋亡或者凋亡細(xì)胞率太低-建議：提高凋亡劑的濃度或者延長凋亡誘導(dǎo)時間 |
未見到DNALadder | *分離的DNA產(chǎn)量太低-建議：加大起始細(xì)胞處理量，按比例擴大試劑使用量。確保做了步驟7，以免乙醇?xì)埩艚档拖疵撔省?/span> *樣品本身含有DNA量少（如人全血），電泳上樣量太低，-建議：可以加大洗脫下來純化DNA的電泳上樣量。 |
DNA彌散，未見Ladder | *凋亡晚期，非特異的剪切DNA所致-建議：在凋亡較早期時提取DNA Ladder（或者做多個不同時期動態(tài)連續(xù)檢測）。 |
背景高， | *RNA污染太多，影響了觀測-建議：將洗脫的純化DNA加入DNase free的RNase 至終濃度2μg/ml，室溫（15℃-20℃）放置20分鐘降解污染的RNA。此外, 正常細(xì)胞含有更多的RNA,凋亡細(xì)胞比例過低時易殘留更多RNA,因此RNA殘留較多,往往提示凋亡細(xì)胞比例過低,可以根據(jù)實際情況調(diào)整誘導(dǎo)條件. |
凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒 核酸提取
